Bildung von L-Isoleucin mit Corynebacterium glutamicum und Analysen zur Genregulation des ilvBNC-Operons

Morbach, S.

Book/Report

FZJ-2019-02015

Bildung von L-Isoleucin mit Corynebacterium glutamicum und Analysen zur Genregulation des ilvBNC-Operons

Morbach, S. (Corresponding author)FZJ*

1997
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag Jülich

Jülich : Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag, Berichte des Forschungszentrums Jülich 3398, 105 p. (1997)

Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/21973

Report No.: Juel-3398

Abstract: $\textit{Corynebacterium glutamicum}$ wird seit vielen Jahren zur großtechnischen Gewinnung der Aminosäuren L-Glutamat und L-Lysin eingesetzt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit die L-Isoleucinbildung mit Hilfe molekularbiologischer Methoden gesteigert werden kann und welcher Mechanismus die Expression der Gene der Acetohydroxysäuresynthase reguliert. Die allosterische Regulation der Enzyme des Biosynthesewegs verhindert im Wildtyp die Überproduktion von L-Isoleucin. Zur Überwindung dieser Limitationen wurden 20 isogene Stämme konstruiert, in denen die Aktivitäten regulierter und feedback-resistenter Enzymeunterschiedlich stark erhöht waren. Die Charakterisierung der Stämme zeigte, daß nur 16 mM L-Isoleucin ausgeschieden wurde, wenn jeweils eine Kopie der Gene, die für die deregulierten Schlüsselenzyme Aspartatkinase, Homoserindehydrogenase und Threonindehydratase kodieren, im Genom vorlag. Die L-Isoleucinkonzentration konnte mit dem Stamm SM13 auf 65 mM vervierfacht werden, wenn die Aktivitäten der $\textit{feedback}$-resistenten Homoserindehydrogenase und Threonindehydratase durch Expression der Gene von $\textit{high copy number}$-Plasmiden erhöht wurden. Die gleichzeitige Expression der Threoninsynthase hingegen ermöglichte keine weitere Steigerung der Produktbildung. Der Stamm SM 13 erreichte eine sehr hohe spezifische Produktivität von 0,1 g L-Isoleucin/g Tg $\ast$ h und eine Selektivität von 0,24 g L-Isoleucin/g Glukose. In einer Pilotfermentation (Degussa AG, Hanau) wurden mit SM13 30 g/l L-Isoleucin gebildet. Überraschenderweise wurden in diesem Stamm intrazellulär L-Isoleucin und dessen direkte Vorstufe $\alpha$-Ketomethylvalerat in Konzentrationen von 110 bzw. 13 mM akkumuliert, wogegen extrazellulär nur Konzentrationen von 65 bzw. 2,5 mM nachweisbar waren. Damit ist eine weitere Steigerung der Produktbildung vermutlich nicht durch die zelluläre Synthese, sondern durch den Export der Aminosäure limitiert. Die AHAS ist das Schlüsselenzym der Biosynthese der verzweigtkettigen Aminosäuren. Die Expression der korrespondierenden Gene $\textit{ilvB}$ und $\textit{ilvN}$ wird durch Attenuation reguliert. Die Analyse der mRNA-Leitsequenz stromaufwärts des $\textit{ilvB}$-Gens zeigte, daß sowohl Sekundärstrukturen mit Ähnlichkeiten zu Merkmalen der translationsabhängigen als auch der translationsunabhängigen Attenuation enthalten sind. Zur Bestimmung der tatsächlich vorliegenden Attenuationsform wurden 12 Mutanten herstellt, die Basenaustausche oder Deletionen in der Sequenz stromaufwärts des $\textit{ilvB}$-Gens enthielten. Mit Hilfe von $\textit{lacZ}$-Fusionen wurde die Aminosäure-abhängige Expression der $\textit{ilvBN}$-Gene quantifiziert. Es zeigte sich dabei, daß die Synthese des Leitpeptids für die Transkription des Operons essentiell ist und daß der intrazelluläre Gehalt der verzweigtkettigen Aminosäuren mit Hilfe regulatorischer Kodons in der Sequenz des Leitpeptids detektiert wird. Somit liegt die translationsabhänigige Attenuation vor. Da der Transkriptionsstart der mRNA mit dem Startkodon des Leitpeptids übereinstimmt, konnte damit erstmals gezeigt werden, daß die Translationsinitiation eines Leitpeptids auch ohne eine Shine-Dalgarno-Sequenz erfolgen kann.

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